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交互扣除RNA差別顯示技術(RSDD)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
交互扣除RNA差別顯示技術(RSDD)是由Kang等于1998年最新提出的結合扣除雜交和RNA差別顯示兩項技術發(fā)展而出的一種有效、快速分離差別表達基因序列的方法。該方法應用于腫瘤進展的研究,可鑒定和克隆已知的和高比率(>65%)的未知序列,這包括分別作為增強和抑制表達進展功能的cDNAs,分別稱為增強進展基因(PEGen)和抑制進展基因(PSGen)。1999年通過交互扣除RNA差別顯示技術已鑒定出了16條差別表達的基因,其中有5條為未知的PEGen,6條為未知的PSGen。該方法主要由三部分組成:
交互扣除(reciprocal subtraction):首先是要獲得兩個具有差別基因表達的細胞系的cDNA文庫,然后將這兩個文庫進行交互扣除雜交,從而獲得兩個扣除cDNA文庫。隨后通過體內(nèi)剪切得到質粒cDNA文庫;
差異顯示(differentialdisplay):由交互扣除cDNA文庫獲得的純化質粒可直接進行差異顯示,這包括PCR擴增(加入3種3′錨定引物和18種5′隨機引物)和進行5%序列膠電泳并切割回收差異顯示條帶;
表達分析(expression analysis):運用反向Northern印跡分析(reverse Northern blotting)和Northern Blot分析鑒定經(jīng)再擴增的DNA片段的差異表達。反向Northern Blotting是將經(jīng)差異顯示得到的擴增后的DNA片段轉膜,并分別與來自兩個不同細胞系總RNA經(jīng)反轉錄制備的32P標記的cDNA第一鏈探針(reverse transcribed 32P-cDNA prob)進行雜交。234條再次擴增的DNA片段中有181條被探測到(77%),其差異表達顯示水平比兩種細胞間Northern blot分析要高1.8倍。最后經(jīng)Northern blotting分析得到兩種細胞系差別表達的DNA片段被克隆到載體上進行測序分析。RSDD目前被證實對于有效且快速鑒定發(fā)生在復雜基因組以及細胞生理變化中差異表達的基因是很有價值的。
 
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