|
對(duì)照組的總RNA提取 mRNA完整性鑒定 |
|
實(shí)驗(yàn)組的總RNA提取 mRNA完整性鑒定 |
|
↓ ↓ |
||
|
錨定引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA |
|
錨定引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA |
|
↓ ↓ |
||
|
采用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增 |
|
采用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增 |
↓ ↓
|
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析 |
ß
|
差異性條帶的回收與第二次擴(kuò)增 |
ß
|
Northern雜交，Southern雜交再次確定差異性條帶的真實(shí)性 |
ß
|
差異性條帶的克隆、測(cè)序、分析，DNA及氨基酸序列聯(lián)機(jī)檢索 |
ß
|
以差異性條帶為探針克隆出基因組文庫中的基因 序列及cDNA文庫中的全長(zhǎng)cDNA序列 |
ß
|
基因功能的鑒定： ①knock out ②dominant negative mutation ③原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中的表達(dá)翻譯。抗體的制 備，細(xì)胞內(nèi)的定位，抗體抑活等等。 ④one hybrid判斷出該基因的“啟動(dòng)”基因。 ⑤two hybrid判斷出該基因的產(chǎn)物的作用途徑。 |
這里以CLONTECH公司生產(chǎn)的DeltaTM Differential Display Kit為例，介紹具體的實(shí)驗(yàn)步驟。該試劑盒中含有10種任意引物和9種Oligo(dT)引物。
