在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時(shí)間縮短，而堿性化合物延長；

緩沖液可以緩沖溶液pH的改變，緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時(shí)能緩沖pH，就是說添加酸或堿時(shí)pH的變化很小。這個(gè)保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機(jī)溶劑。當(dāng)加入有機(jī)溶劑時(shí)，pKa會(huì)有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會(huì)有一樣的變化。

對(duì)于液相常用濃度來說，緩沖液應(yīng)維持在緩沖鹽的pKa的1.5個(gè)pH單位左右，當(dāng)濃度特別稀的時(shí)候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大概+/-1個(gè)pH單位。

表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）

建議在開發(fā)方法的時(shí)候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍，然后用溶液的選擇性微調(diào)分離。這個(gè)策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。

1）建議溫度設(shè)置在25℃-40℃，適當(dāng)?shù)闹鶞乇３至己玫谋Ａ魰r(shí)間的重現(xiàn)性，一定程度上提高柱效，增加分離度。

2）柱溫過低，流動(dòng)相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。

3）柱溫太高，與檢測器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對(duì)試劑或緩沖鹽對(duì)硅膠基質(zhì)的攻擊，硅膠溶解，縮短色譜柱的壽命；柱溫太低，使得需要制冷的柱溫箱，硬件要求太高，不利于方法的推廣。

4）溫度的改變會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，如果儀器自動(dòng)進(jìn)樣過夜或過周末，就會(huì)發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間隨著實(shí)驗(yàn)室溫度的改變而產(chǎn)生漂移，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。