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1、背景
氨甲酰磷酸是生物合成代謝中精氨酸與嘧啶的重要前體物質(zhì)，在工業(yè)微生物生產(chǎn)精氨酸與嘧啶及其衍生物中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
2、目的
在大腸桿菌Escherichia coli BW25113中比較氨甲酰磷酸不同合成途徑的催化效率。
3、方法
在大腸桿菌Escherichia coli BW25113中過表達(dá)鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(OTC)的基礎(chǔ)上，分別過表達(dá)大腸桿菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPS Ⅱ)并表征其反應(yīng)效果。通過優(yōu)化底物供應(yīng)(調(diào)整底物濃度與引入L-谷氨酰胺合成酶)對CK與CPS Ⅱ的催化反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。
4、結(jié)果
在大腸桿菌中過表達(dá)OTC，建立細(xì)胞水平氨甲酰磷酸檢測體系。在此基礎(chǔ)上比較不同來源的CK，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌來源的CK效果最好，50 mmol/L NH4HCO3條件下全細(xì)胞催化9 h得到2.95±0.15 mmol/L L-瓜氨酸；過表達(dá)CPS Ⅱ時(shí)，50 mmol/L L-谷氨酰胺催化9 h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通過改變底物NH4HCO3濃度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式對CK與CPS Ⅱ的催化反應(yīng)分別進(jìn)行優(yōu)化后，100 mmol/L NH4HCO3條件下，L-瓜氨酸濃度分別提高至4.67±0.55 mmol/L和6.12±0.38 mmol/L，且過表達(dá)GS后CPS Ⅱ途徑可以利用NH3，不需要額外添加L-谷氨酰胺。
5、結(jié)論
【結(jié)論】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPS Ⅱ途徑合成氨甲酰磷酸的能力優(yōu)于CK途徑，為精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一種更加高效的策略。
圖1 氨甲酰磷酸的不同合成途徑與L-瓜氨酸合成途徑
Figure 1 Different carbamoyl phosphate synthetic pathways and L-citrulline synthetic pathway
圖2 SDS-PAGE分析不同來源CK的蛋白表達(dá)(A)與催化能力比較(B)
Figure 2 SDS-PAGE analysis of expressions of CKs from different species (A) and comparison of catalytic capacity of CKs (B)
圖3 SDS-PAGE分析CPS Ⅱ的蛋白表達(dá)(A)與催化效果(B)
Figure 3 SDS-PAGE analysis of expression of CPS Ⅱ (A) and catalytic effect (B)
圖4 NH4HCO3濃度對菌株ECFI合成氨甲酰磷酸的影響
Figure 4 Effects of different concentrations of NH4HCO3 on synthesizing carbamoyl phosphate by strain ECFI
圖5 引入兩岐雙岐桿菌來源GS對CPS Ⅱ途徑的影響(A)，以及降低L-谷氨酰胺添加量對菌株GSABFI的影響(B)
Figure 5 The effect on CPS Ⅱ synthesis with the introduction of GS from Bifidobacterium bifidum (A), and the effect of reducing the amount of L-glutamine on the strain GSABFI (B)
圖6 兩種合成氨甲酰磷酸途徑的比較
Figure 6 Comparison of two carbamoyl phosphate biosynthesis pathways
