材料與試劑

1．α－萘酚液

α一苯酚 1.00g

40%乙醇 100.00ml

3%H2O2 0.20ml

混合即可,現用現配。

2．派洛寧液

派洛寧(Pyroming) 0.10g

苯胺(Aniline) 4.00g

40%乙醇 96.00ml

3．內源性酶抑制劑：0.01%H2O2的0.01%的疊氮鈉溶液。

1%H2 O2 1.00ml

1%Na N3 1.00ml

0.015mol/L pH 7.4 PBS液 100.00ml

4．0.05Mol/L pH 7.6 Tris－HCl緩沖液

A液：0.2mol/L Tris液

三羥甲基氨基甲烷 2.43g

H2 O 100.00ml

B液：0.1mol/L HCl

取A液25ml，B液38.9ml，混合，加蒸餾水至100ml即可。

5．DAB液(Karnovsky液)

0.05Mol/L pH 7.6 Tris－HCl緩沖液 100.00ml

3，3－二胺基聯苯胺鹽酸鹽 76mg

1% H2 O2 0.5ml

配后立即使用。

6．0.10Mol/L pH7.4 PBS液。

操作方法

1．豬瘟酶標抗體工作滴度的確定 對組化法來說，最簡單的確定工作滴度的方法是將酶標抗體進行一系列的倍比稀釋，然后對已知陽性標本片進行染色，以最為清晰的陽性結果的最大稀釋倍數或稍提高1～2滴度作為工作滴度。

購買商品豬瘟酶標抗體,則按其說明的工作濃度稀釋即可。

2．待檢標本片的制作 取可疑豬瘟病豬尸體或急宰病豬立即剖檢，采取腎臟、脾臟、淋巴結等臟器進行觸片(或涂片)或冷凍切片(4µm厚度)。余下組織低溫冰箱保存或放于盛有50%甘油鹽水中于普通冰箱保存，以備復檢或比較用。也可采病豬之血作血球粥片。標本片干后，立即以4℃的丙酮液固定15min。固定后的標本片可貯藏于4℃冰箱中備用。

3．染色方法 采用單染法和復染法均可，萘酚復染法操作過程：

⑴ γ－苯酚液染色4min～5min。

⑵ 0.015Mol/L pH7.4 PBS液沖洗10min。

⑶ 派洛寧液染2min。

⑷ PBS沖洗后，用吸水紙吸除水滴。

⑸ 滴加工作濃度的酶標抗體液，以復蓋為度，置濕盒內37℃溫育30min~45min，PBS液沖洗。

⑹ 加DAB液室溫染色30min；

⑺ PBS液沖洗后，餾水中漂洗；

⑻ 干燥后，無水酒精脫水5min，二甲苯透明5min，加拿大膠封片。

DAB單染法：

⑴ 滴加內源性酶抑制劑30min。

⑵ 0.015Mol/L pH 7.4 PBS沖洗液10min。

以下步驟同復染法⑸～⑻。

2．對照組的設置：首次染色時,應設立如下對照。

⑴ 已知陽性標本的對照。

⑵ 已知陰性標本的對照。

⑶ 抗體抑制試驗對照，即在標本上加有與酶標抗體來源不同的另一個體的抗豬瘟抗體處理(37℃作用45min)。再以酶標抗體染色應為陰性。

⑷ DAB－H2O2底物染色對照，即不加酶抗體，只加DAB－H2O2液。以檢查內源性酶被抑制的情況。

結果判定

在對照組成立的前提下，α－萘酚復染法：在細胞漿內酶標抗體抗原復合物呈黃褐色,內源性酶被染成紅色,背景為淺棕色；單染法：在細胞漿內，酶標抗體抗原復合物呈黃褐色,背景成淡黃色或無色。

注意事項

1．標本必須新鮮，否則非特異性反應重。

2．固定劑的選擇應以不影響抗原的活性又不妨礙抗體進入細胞為原則。病毒標本的固定劑一般選用冷甲醇和丙酮。

3．消除內源性酶的辦法：

⑴ 以0.30％～3%H2O2液室溫處理標本15min～30min；

⑵ 0.10%苯肼37℃處理1h；

⑶ 0.074%鹽酸乙醇液(100ml乙醇含0.20ml濃鹽酸)，室溫處理15min。

4．消除背景染色的辦法 背景染色可以是特異性的，因為細胞漿的外溢和炎性浸潤造成。但大量的是非特異性的，主要是由于組織成分對免疫球蛋白的非特異性吸附所致，可以采用以下辦法消除。

⑴ 切片以0.30％～3% H2O2作用后,再以10%卵蛋白作用30min。

⑵ 以0.05%吐溫-20和含有0.10%牛血清白蛋白的PBS液預處理。

如果采用間接法測定抗原，則可采用下法來消除背景的染色。

⑶ 以與第一血清不同種類的正常動物血清做預處理。

⑷ 用來自于酶標記第二抗體的同種動物的血清做預處理,也可用這種血清來稀釋第一抗體。

5．抗體濃度和酶標抗體濃度的確定 直接法測定的酶標抗體濃度是以不同梯度的稀釋經過試驗而定。間接法測定的第一抗體濃度和第二酶標抗體濃度的確定，則必須進行雙方陣試驗預以選擇�？贵w濃度和酶標抗體濃度的確定均不宜過高或過低。過高易出現非特異性反應，過低則影響檢出的敏感性。