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地高辛-堿性磷酸酶(Dig -AKP)標記DNA探針

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

  1.組織前處理

  (1)固定:組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚4~6μm,粘附于涂有粘附劑的玻片上,入烤箱60~80℃6~8h,使切片更緊貼玻片。
  (2)脫蠟:二甲苯10min ×2,自100%乙醇,90%,70%,50%,30%各5min。入PBS(含5mmol/l MgCl2,pH7.3~7.4)10min×2。入0.2n HCl 20min以進一步去除蛋白。
  (3)50℃2×SSC,含5mmol/l EDTA溶液中30min。
  (4)蛋白酶K(1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中,)37℃20~25min。
  (5)0.2mol/l 甘氨酸液:室溫10min,中止蛋白酶反應。
  (6)4%多聚甲醛(PBS新鮮配制):室溫20min。
  (7)PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。
  (8)脫水,自低濃度到高濃度,無水乙醇各3min,空氣干燥。

  2.預雜交封閉非特異性雜交位點,20μl/每張切片,42℃水浴半小時。

  3.雜交10~20μl/每張切片,加蓋硅化蓋玻片,將切片置于95℃min,使探針及病毒DNA變性,然后迅速置于冰上1min(也有報告用乙醇使之冷卻的),然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內,42℃過夜(16~18h)。

  4.雜交后漂洗

  (1)2×SSC液內振動移除蓋片。
  (2)2×SSc 55℃10min×2。
  (3)0.5×SSc 55℃5min×2。
  (4)緩沖液II(含0.5%封阻試劑,用緩沖液I溶解)37℃30min。
  (5)緩沖液I(10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5)15min,室溫。
  (6)酶標地高辛抗體(1:5000,應用緩沖液I稀釋)37℃30min。
  (7)緩沖液i 15min×2室溫。
  (8)緩沖液III(100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5)室溫2min。

  5.顯色

  (1)顯色液配制:緩沖液III:1ml中加入4.5μl四氮唑藍(NBT),3.5μl X-磷酸鹽(5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽(BCIP配成))。30μl/每張切片,置暗處顯色30min到2h。定時抽查切片,鏡檢其顯色情況。
  (2)緩沖IV(10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)10min終止反應,甲綠復染5min,二甲苯透明,DPX封固,鏡檢。

 
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