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RAPD操作要點

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06
  一、 材料
  不同來源的DNA(50ng/ul)。
  二、設備
  PCR儀,PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管,電泳裝置。
  三、試劑
  1、隨機引物(10mer) (5umol/L):購買成品。
  2、Taq酶:購買成品。
  3、10xPCR 緩沖液:配方見第八章。
  4、MgCl2 :25mmol/L。
  5、dNTP:每種2.5mmol/L。
  四、操作步驟:
  1. 在25ul反應體系中,加入
    模板DNA 1ul (50ng)
    隨機引物 1ul (約5pmol)
    10xPCR Buffer 2.5ul
    MgCl2 2ul
    dNTP 2ul
    Taq酶 1單位(U)
    加ddH2O 至 25ul
  混勻稍離心, 加一滴礦物油。
  2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘, 36℃ 1分鐘, 72℃ 1分鐘,共40輪循環(huán)。
  3. 循環(huán)結束后, 72℃ 10分鐘,4℃保存。
  4. 取PCR產物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊, 分辨率高)。
  5. 電泳結束,觀察、拍照。
  [注意] 1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
      2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個新的分子標記應用。
 
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