眾所周知，ROS在細(xì)胞生命，應(yīng)激和死亡中具介導(dǎo)作用，今天來聊下ROS。

ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種具有氧化活性的化學(xué)物質(zhì)，包括過氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理?xiàng)l件下也會(huì)產(chǎn)生，但當(dāng)其產(chǎn)生過多或清除不足時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測(cè)方法

目前有多種方法用于檢測(cè)ROS，包括熒光染色法、電子順磁共振技術(shù)（EPR）、化學(xué)發(fā)光法、色譜法、分光光度法、電化學(xué)生物傳感器以及基于熒光蛋白等七種。在這里，我們將著重介紹熒光染色法，以及其在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS時(shí)的原理和操作步驟。

檢測(cè)原理

目前，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS最廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞，它會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無法穿過細(xì)胞膜，因此熒光探針會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，在最大激發(fā)波長(zhǎng)480nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)熒光信號(hào)。

檢測(cè)步驟：

1. 裝載探針

對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽(yáng)性對(duì)照孔中加入Rosup作為陽(yáng)性對(duì)照，其余孔不必加入Rosup。

2. 檢測(cè)

對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

注意事項(xiàng)

1、在完成探針裝載后，務(wù)必充分清洗，去除未進(jìn)入細(xì)胞的探針殘余，以避免引發(fā)高背景信號(hào)。
2、探針裝載和清洗完成后，可執(zhí)行激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，確保探針裝載狀況良好。
3、為降低各類誤差，建議盡量縮短探針裝載后至測(cè)定時(shí)的時(shí)間（刺激時(shí)間除外）。