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| 一、目的要求 |
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1.掌握反相離子對色譜分離水溶性纖維素的方法。
2.了解反相離子對色譜分離水溶性纖維素的原理及方法特點。
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| 二、基本原理 |
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水溶性纖維素包括：VB1 (硫胺素)，VB2(核黃素)，VB5(煙酰胺，煙酸)，VB6(吡哆醛、吡哆醇)，VB11（葉酸），VB12(鈷
維生素)和VC等。在用反相離子對色譜法測定中，陽離子A+(樣品離子)和反離子B-(烷基磺酸根離子)先形成離于對，再在
流動相和固定相中分配，
保留時間為：
tR=tM (1+ EA，B[B-]水相/β)
式中，β為相比，tM為死時間，EA，B為平衡常數。
可見樣品的保留時間受離子對試劑的濃度和可逆過程的總平衡常數的影響。因此，對混合水溶性纖維素分離的影響，
除反離子的濃度外，還有流動相的pH值，甲醇與水的配比，有機添加劑三乙胺(TEA)濃度和柱溫。TEA作為流動相的添加
劑，可減少堿性樣品色譜峰的拖尾。
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| 三、儀器與試劑 |
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1．儀器高效液相色譜儀；超聲波發生器。
2．試劑：
甲醇；十二烷基磺酸鈉；三乙胺；水溶性纖維素混合標樣。
混合標樣配制方法：
將VB1、煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、VB12和VC溶于水配成含量均為30μg／m1的水溶液(溶液1)。將VB2和VB11滴入少
量發5％Na0H使之溶解，再用去離子水稀釋至各含100μg／m1的混合液(溶液2)。使用前，將溶液l和溶液2以1：1混合
，配成含9種纖維素的混合標樣。以相應的方法制成各維生素的單個標樣。
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| 四、實驗步驟 |
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1．實驗條件：
1) 色譜柱：YWG—G18，10μm，25cm×φ4.6mm；
2) 流動相：甲醇：水=40：60，十二烷基磺酸鈉1.5mmol/l，三乙胺0.3％，用磷酸調節PH至3.0；
3) 檢測器：UV—254nm；
4) 流動相流速：1.0mI／mln；
5) 校溫：30℃。
2．啟動儀器，用大約180m1流動相流經色譜拄，待基線穩定后，分別注入10μl的各單個維生素標樣，記錄色譜圖
和出峰時間。
3．注入10μll混合試樣，記錄色譜圖和各峰的出峰時間。
4.實驗結束，用90％甲醇一水溶液沖洗色譜拄1h左右。
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| 五、數據處理 |
| 根據標樣的保留時間找出混合試樣色譜圖中各峰對應的樣品名稱。 |
| 六、問題討論 |
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１.試述反相離子對色譜的分離機理。
２.反相離子對色譜同時分離混合水溶性纖維素有哪些影響因素？
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| 七、渣意事項 |
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1.制備流動相用試劑均為分析純，水用二次蒸餾水，維生素為生物試劑。
2.用庚烷鹽作為離子對試劑效果更優，但其價格較貴。
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