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食物中膽固醇的測定方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2005-10-26
食物中膽固醇的測定方法主要有氣相色譜法和比色法。色譜法必須具備氣相色譜儀,此儀器價格昂貴,故在國內(nèi)不易普及,因此選用經(jīng)濟(jì)、簡便、實用的比色法進(jìn)行食物中膽固醇的測定。

比色法

1.原理
  固醇類化合物與酸試劑作用,可脫水,發(fā)生聚合反應(yīng)并產(chǎn)生強(qiáng)的顏色反應(yīng)。

2.適用范圍
  此方法適用于動物性食物中膽固醇的測定。

3.儀器
(1)實驗室常用設(shè)備
(2)分光光度計
(3)電熱恒溫水浴

4.試劑
  所有試劑,如未注明規(guī)格,均指分析純,所有實驗用水,均為蒸餾水。
(1)石油醚
(2)無水乙醇
(3)濃硫酸
(4)冰乙酸(優(yōu)級純)
(5)磷酸
(6)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)(美國Sigma公司)
  標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取膽固醇100mg,(膽固醇標(biāo)準(zhǔn)開啟后放在干燥器內(nèi))溶于冰乙酸中,并定溶至100ml。其濃度為1g/L。可保存2個月。
  標(biāo)準(zhǔn)工作液:取標(biāo)準(zhǔn)儲備液10ml,用冰乙酸定溶至100ml。其濃度為0.1g/L。此液用時臨時配制。
(7)鐵礬顯色液:
  儲備液:溶解4.463克硫酸鐵銨[FeNH4(SO4)2·12H2O]于100ml 85%磷酸中貯于干燥器內(nèi),此溶液在室溫中穩(wěn)定。
  * 鐵礬儲備液須在實驗前兩周配制,因硫酸鐵銨不易溶解,每天要進(jìn)行短時間的振搖待溶質(zhì)完全溶于磷酸后再定溶到體積。
  工作液:吸取儲備液10ml用濃硫酸稀釋到100ml。貯于干燥器內(nèi)。
(8)氫氧化鉀50%溶液:溶解50g氫氧化鉀于水中,定溶至100ml。
(9)氯化鈉5%溶液:溶解5克氯化鈉于水中,定溶至100ml。
(10)純氮(99.99%)

5.操作步驟

5.1樣品脂肪的提取與測定:根據(jù)食物種類分別用索氏提取法、研磨法和羅高氏法提取脂肪,并計算出每100克食物中脂肪含量。

5.2樣品膽固醇的測定:準(zhǔn)確稱取提取的油脂3-4滴(約含膽固醇300-500μg) 取樣量可按樣品中膽固醇的濃度增減。置于25ml試管內(nèi),加入4ml無水乙醇,0.5ml50%氫氧化鉀,在65℃恒溫水浴中皂化1小時。皂化時每隔20-30分鐘振搖一次使皂化完全。皂化完畢,取出試管,冷卻。加入3ml 5%氯化鈉、10ml石油醚,蓋緊玻璃塞,振搖2分鐘,靜置分層(一般需1小時以上)。

  取上層石油醚2ml,置于10ml具玻璃塞的試管內(nèi),在65℃恒溫水浴中用氮?dú)獯蹈桑尤?ml冰乙酸,2ml鐵礬顯色液,混勻,放置15分鐘后560-575nm下比色。
5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確吸取膽固醇工作液0;0.5;1.0;1.5;2.0ml分別置于10ml試管內(nèi),在各管內(nèi)加入冰乙酸,使總體積達(dá)4ml。沿管壁加2ml鐵礬顯色液,混勻,在15-90分鐘內(nèi),560-575nm下比色。

6.分析結(jié)果
  樣品中膽固醇含量(mg/100g)=C×V/V'×1/W×F/1000
式中
  C=測得的光密度值在膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線上顯示的膽固醇量(μg)
  V=石油醚總體積(ml)
  V'=取出的石油醚體積(ml)
  W=稱取油脂重量(g)
  F=樣品的脂肪含量(g/100g)
  1/1000=折算成每100克食物中膽固醇的毫克數(shù)。

7.注意事項
  同一實驗室同時或連續(xù)兩次測定結(jié)果之差不得超過平均值的10%。
 
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