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酶標對流免疫電泳

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-27

(一)原理
利用酶標記抗原(抗體)和待測抗體(抗原)在電場中向一定方向移動,在比例適當的地方形成沉淀線,通過酶作用底物而顯色,指示沉淀線的存在。該法的敏感性大大高于對流免疫電泳。
本試驗以檢測血吸蟲抗體為例。
(二)材料與試劑
1.0.02Mol/pH 8.6巴比妥緩沖液
巴比妥 0.553g
巴比妥鈉 3.503g
乳酸鈣 0.512g
H2O 加至 1 000ml
2.0.1Mol/L pH7.0PBS(0.14Mol/L Nacl)
3.0.2Mol/L pH7.6硼酸緩沖液
硼酸 10.510g
硼砂 2.860g
H2O 加至 1000ml
(三)操作方法
1.酶標抗原的制備 用1ml血吸蟲卵抗原(蛋白含量為1.5mg/ml~2.0mg/ml)加入3mg~4mg辣根過氧化物酶(蛋白質:酶=1︰2),液體呈棕紅色,然后在輕輕攪拌下,緩慢加入50μl 1%戊二醛,要求在5min~10min內滴加完畢。置20℃~25℃攪拌2h。裝入透析袋,于1000ml、0.1Mol/L pH7.0PBS液4℃透析2天,并換液3次~4次。取出酶標記物加等量純甘油,使含50%甘油試劑,即為酶標抗原。分裝小瓶,存于-20℃中備用。
2.瓊脂凝膠板的制備 取優質瓊脂,以0.02Mol/L pH8.6巴比妥緩沖液制成1%瓊脂,溶化后,置于玻片上,制成2mm厚的凝膠板。
3.打孔加樣 打6對孔,抗原孔徑為0.30cm,抗體孔為長方形0.2cm×1.1cm。抗原、抗體各加5μl及50μl。抗原用上述酶標抗原做1︰20至1︰30稀釋。
4.電泳 抗原孔置于負極,電壓4 V/cm ~5V/cm,電泳時間45min~60min,電泳后,于蒸餾水中蕩洗1min~2min即可,用濾紙吸去水分,并用毛細吸管吸盡長孔及圓孔中的水液后,即可用底物的溶液顯色。
5.配制底物溶液,現用現配。將飽和聯苯胺溶液,加等量pH7.6硼酸緩沖液,然后將上液9份和0.1%過氧化氫1份相混,即為所需的底物溶液。
6.免疫酶染色 將瓊脂凝膠板置于培養皿中,緩緩傾入底物溶液,直至浸沒凝膠板為止,置于室溫或37℃,經1h~2h用目測可觀察反應結果。
(四)結果判定
1.陽性反應:在抗原抗體孔之間呈現明顯的棕紅色的線條。
2.陰性反應:不出現棕紅色線條者。

 
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